Рекомбінантна ДНК

Рекомбінантна ДНК — штучно створені молекули ДНК за допомогою методів генетичної рекомбінації, які поєднують генетичний матеріал різного походження. На відміну від природньої рекомбінації генетичного матеріалу, рекомбінантні ДНК створюються за допомогою низки лабораторних методів.

Клонування послідовностей полягає у збільшенні їхньої кількості за посередництва бактеріальних чи інших клітин, у яких може розмножуватися ДНК-вектор. У клітині-хазяїні утворюються ідентичні копії вектора зі вставленим у нього фрагментом ДНК. Під час поділу клітин рекомбінантні молекули ДНК передаються до нащадків цієї клітини. З часом утворюються колонії бактерій, які складаються з ідентичних клонів вихідної клітини, кожен з яких має одну або більшу кількість копій рекомбінантної ДНК. Цільовий фрагмент ДНК, часто це ген, у складі молекули рекомбінантної ДНК називають клонованим. Унаслідок експресії рекомбінантної ДНК, можуть синтезуватися рекомбінантні білки або молекули РНК.

Поєднання молекул ДНК з різних організмів можливе через їх однакову хімічну природу, хоча такі молекули різняться за нуклеотидними послідовностями, через що рекомбінантну ДНК також називають химерною.

Перші рекомбінантні молекули ДНК були створені у 1973 році Полом Бергом, Гербертом Боєром, Енні Чанг і Стенлі Коеном зі Стенфордського університету та Каліфорнійського університету в Сан-Франциско. У 1975 році на «Асиломарській конференції^[en]» обговорювалося регулювання та безпечне використання технології рекомбінантних ДНК. Однак з середини 80-х років минулого століття поступово зростає кількість продуктів, створених за допомогою рДНК.

Інструменти та етапи створення рекомбінантної ДНК

Для утворення рДНК потрібні ферменти - ендонуклеази рестрикції, лігази.

Ендонуклеази - це ферменти, які розщеплюють молекулу ДНК у специфічних послідовностях або поблизу них, котрі складаються з чотирьох-восьми пар основ. Ендонуклеази у організмах бактерій є природним явищем (для захисту від проникнення чужинної ДНК, наприклад вірусу), яке використовують у лабораторній техніці . Багато нуклеаз непридатні для використання у біотехнології, оскільки розщеплюють молекули ДНК випадковим чином, як результат – утворюється набір фрагментів різного розміру. Тому послуговуються ферментами, які зв’язуються з відомими сайтами на ДНК, бажано щоб вони були унікальними, що сприятиме утворенню меншої кількості фрагментів .

Багато рестрикційних ендонуклеаз роблять простий дволанцюговий розріз в середині послідовності розпізнавання, що призводить до утворення тупого кінця або липкого (когезивного), який містить короткі одноланцюгові виступи на кожному кінці молекули. У останньому випадку за рахунок комплементарності, кінці розрізаної молекули ДНК можуть об'єднуватись між собою. Ендонуклеази рестрикції з різними послідовностями розпізнавання можуть утворювати однакові липкі кінці. Наприклад, BamHI (послідовність розпізнавання GGATCC) і BglII (AGATCT) створюють липкі кінці GATC .

Результат дії рестриктаз на молекули ДНК можна перевірити, провівши електрофорез у агарозному гелі. Для визначення розміру фрагментів використовують маркер мас.

Лігазами для генетичної інженерії послуговуються, щоб відновити розриви, які виникли в одному з ланцюгів дволанцюгової молекули та з'єднати разом окремі молекули ДНК або кінці однієї молекули шляхом створення двох фосфодиефірних зв'язків (по одному на кожен ланцюг) .

Етапи створення рДНК

1. Відбір цільової послідовності, плазміди, ферментів.

2. Розщеплення відібраної молекули ДНК та плазміди ендонуклеазами рестрикції.

3. Лігування фрагменту ДНК та плазміди ДНК-лігазами, як наслідок утворюється векторна молекула. Крім послідовності інтересу вектор має містити гени, які б забезпечували відбір клітин, які містять вектор зі вставленою цільовою послідовністю.

4. Введення вектора у бактеріальну клітину, в якій відбуватиметься ампліфікація послідовності у складі вектора сумісно з поділами клітин.

5. Відбір мікроорганізмів з рекомбінантними вектором з геном інтересу .

Експресія ДНК

У бактеріях чи інших організмах, в яких відбувалася ампліфікація вектора з послідовністю інтересу, експерсія рДНК може відбуватися або ні. У випадку експресії можна отримувати транскрипти з цієї послідовності та рекомбінантні білки. До складу плазмід експерсії входять реплікони, промотори, селективні маркери, множинні сайти клонування, послідовності видалення злитого (рекомбінантного білка). Реплікон складається з одного сайту початку реплікації та пов’язаних з ним cis-діючих елементів. Слід підбирати копійність плазміди, оскільки збільшення кількості плазмід сприятиме зростанню концентрації білка в клітині, що може викликати метаболічне навантаження, яке зменшуватиме швидкість росту бактерій, збільшуватиме нестабільність плазмід. Найбільш поширеними промоторами є lac промотор, промотор фагу Т7. Промотори підбирають залежно від сили та його регулювання. Селективними маркерами є переважно гени антибіотиків (ампіциліну, канаміцину, тетрацикліну та ін.), які використовують для відбору трансформованих клітин. Крім того, додають послідовності, які забезпечували б:

1) виявлення гена за його експресією з подальшим очищенням;

2) досягненням розчинності;

3) очищення від компонентів клітини-господаря та культурального середовища.

Ці три пункти можна забезпечити шляхом наявності амінокислотної послідовності (пептидної мітки) або великого поліпептиду (партнера злиття) у тандемі з білком-інтересу, у такому випадку утворюється химерний білок . Можуть додаватися послідовності, які спрямовуватимуть білок у певне місце (клітинний компартмент або позаклітинне середовище), сприятимуть (для уникнення деградації ферментними системами клітини-господаря) .

Відбір організмів, які містять рекомбінантну ДНК

Переважно організми, які містять рДНК мають нормальний фенотип, тобто їх морфологія, метаболізм не змінилися, порівняно з організмами без такої ДНК. Щоб визначити наявність рекомбінантних послідовностей зазвичай використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Якщо ген інтересу експресується у складі вектору, то можна виявити РНК та/або білки за допомогою реакції зворотньої транскрипції (Reverse transcription polymerase chain reaction^[en], RT-PCR) або шляхом вестерн-гібридизації . У деяких випадках можуть спостерігатися значні зміни фенотипу, що не є нормою. Однак якщо обраний ген, продукт якого здатний генерувати біологічну активність в організмі господаря, то це можлива ситуація. Прикладами є токсичність рекомбінантного білка для організму господаря, особливо якщо він надмірно експресується або експресується в невідповідних клітинах або тканинах у випадку багатоклітинних організмів-господарів.

У деяких випадках рекомбінантна ДНК може мати шкідливий вплив, навіть якщо вона не експресується. Одним із механізмів, за допомогою якого це відбувається, є інсерційна інактивація, за якої рДНК вставляється в ген клітини-господаря. У деяких випадках дослідники використовують це явище, щоб "нокаутувати" гени ("knock out") та визначити їхню біологічну функцію. Інший механізм, за допомогою якого вставка рДНК у хромосому може впливати на експресію генів – активація раніше мовчазних генів клітини-господаря. Це може статися, наприклад, коли фрагмент рДНК з активним промотором розташовується поруч із раніше неактивним геном клітини-господаря, або коли хазяйський ген, функціональність якого пригнічує експресію іншого гена, піддається інсерційній інактивації рекомбінантною ДНК.

Застосування технології рекомбінантної ДНК

рДНК широко використовується у дослідженнях, біотехнології та медицині, ветеринарії, сільському господарстві, біоінженерії, для отримання комерційних продуктів для людини та тварин, отримання самих тварин. Наприклад, GloFish є зарестрованим торговим брендом, який продає генетично модифікованих акваріумних рибок, які здатні до флуоресценції . Рекомбінантна ДНК використовується для ідентифікації, картування та секвенування генів, а також для визначення їхньої функції. рДНК використовують як зонди для вивчення експресії генів в окремих клітинах, тканинах цілих організмів. Рекомбінантні білки широко використовуються у експериментах, для створення антитіл, які слугуватимуть зондами у дослідженнях синтезу білка в клітинах і організмах .

Рекомбінантний білок	Характеристика
Хімозин	- фермент, який синтезується у сичузі ВРХ. Традиційно отримують із шлункового соку телят, яких годували молоком; - потрібен для виробництва сирів; - перший генетично модифікований білок, який використовують у комерційних цілях; - у біотехнологічному виробництві для продукування хімозину використовують непатогенний штам К-21 E. coli. Синтезований рекомбінантний білок структурно подібний природному ферменту. Такий спосіб дозволяє здешевити виробництво та отримувати у значно більших кількостях білок; - близько 60% твердого сиру в США виготовляють з використанням генно-інженерного хімозину; - у 1990 році FDA присвоїло хімозину статус «визнаного загалом безпечним» (GRAS) на основі даних, які показують, що фермент безпечний .
Інсулін людини	- традиційно отримують з підшлункової залози свині та ВРХ; - використовують для лікування інсулінозалежного діабету; - рекомбінантний - синтезують шляхом введення гена людського інсуліну в E. coli або дріжджі (Saccharomyces cerevisiae) .
Гормон росту людини (соматотропін)	- призначається пацієнтам, у яких гіпофіз виробляє недостатню кількість соматотропіну для підтримки нормального росту та розвитку; - до створення технології рекомбінантного білка, гормон отримували з гіпофізів трупів, що провокувало у пацієнтів розвиток хвороби Кройтцфельда-Якоба; - препарат використовують у терапевтичних цілях, однак, можливе зловживання .
Фактор згортання крові VIII	- призначають пацієнтам з гемофілією, які не здатні виробляти фактор VIII у достатніх кількостях для підтримки нормального згортання крові ; - традиційна техніка вироблення – використання людської крові від донорів. Недолік такого підходу – ризик передачі інфекційних захворювань, які передаються через кров (ВІЛ, гепатит В). DrugBank entry.
Вакцина проти гепатиту В	- містить поверхневий антиген вірусу гепатиту В, який виробляється в дріжджових клітинах; - розробка рекомбінантної субодиничної вакцини є важливою, оскільки вірус не можна культивувати in vitro. .
Діагностика ВІЛ-інфекції	1. Тест на антитіла (ELISA або вестерн-блот) – використовується рекомбінантний білок ВІЛ для визначення наявності антитіл, які організм виробляє у відповідь на ВІЛ-інфекцію. 2. ДНК-тест – послуговуються полімеразною ланцюговою реакцією зі зворотньою транскрипцією. Розробка такого тесту стала можливою завдяки аналізу послідовностей геномів ВІЛ та молекулярне клонування. Сторінка тестування на ВІЛ від Центру контролю захворювань США (CDC) [2].
Золотий рис	- сорт рису, створений для експресії ферментів, відповідальних за біосинтез β-каротину; - перспективний через можливе зменшення випадків дефіциту вітаміну А у світі; - наразі не використовується через вирішення питань регулювання інтелектуальної власності .
Стійкі до гербіцидів культури	- розроблено комерційні сорти важливих сільськогосподарських культур (сої, кукурудзи, сорго, ріпаку, люцерни та бавовнику) з рекомбінантним геном, який забезпечує стійкість до гербіциду гліфосату (торгова назва Раундап), які використовуються у комерційних цілях; - спрощення боротьби з бур’янами за допомогою гліфосату .
Культури, стійкі до комах	- для боротьби з комахами використовують Bacillus thuringeiensis, які виробляють (Bt-токсин) з інсектицидними властивостями ; - така технологія широко використовується у сільському господарстві та садівництві; - проблеми з впливом (чи його відсутністю) на навколишнє середовище остаточно не вирішені .

1. Brown, T. A. (2006). Gene cloning and DNA analysis : an introduction (вид. 5th ed). Oxford: Blackwell Pub. ISBN 1-4051-1121-6. OCLC 58451766. 
2. Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo A. (17 квітня 2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5. ISSN 1664-302X. PMC PMC4029002. PMID 24860555. doi:10.3389/fmicb.2014.00172. Процитовано 2 листопада 2022. 
3. Khan, Suliman; Ullah, Muhammad Wajid; Siddique, Rabeea; Nabi, Ghulam; Manan, Sehrish; Yousaf, Muhammad; Hou, Hongwei (8 грудня 2016). Role of Recombinant DNA Technology to Improve Life. International Journal of Genomics (англ.) 2016. с. e2405954. ISSN 2314-436X. doi:10.1155/2016/2405954. Процитовано 2 листопада 2022. 
4. Cooper, Geoffrey M. (2000). Recombinant DNA. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition (англ.). Процитовано 2 листопада 2022. 
5. Stryjewska, Agnieszka; Kiepura, Katarzyna; Librowski, Tadeusz; Lochyński, Stanisław (2013-09). Biotechnology and genetic engineering in the new drug development. Part I. DNA technology and recombinant proteins. Pharmacological Reports (англ.) 65 (5). с. 1075–1085. doi:10.1016/S1734-1140(13)71466-X. Процитовано 2 листопада 2022. 
6. Rosenberg, Leon E.; Rosenberg, Diane Drobnis (2012). Structure of Genes, Chromosomes, and Genomes. Human Genes and Genomes (англ.). Elsevier. с. 75–96. ISBN 978-0-12-385212-0. doi:10.1016/b978-0-12-385212-0.00006-8. 
7. L., Rosano, Germán; A., Ceccarelli, Eduardo (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology (English) 0. ISSN 1664-302X. doi:10.3389/fmicb.2014.00172/full. Процитовано 2 листопада 2022. 
8. Burgess, Richard R.; Deutscher, Murray P. (2009). Guide to protein purification (вид. 2nd ed). San Diego, Calif: Academic Press/Elsevier. ISBN 978-0-12-374536-1. OCLC 463300660. 
9. Ye, Xudong; Al-Babili, Salim; Klöti, Andreas; Zhang, Jing; Lucca, Paola; Beyer, Peter; Potrykus, Ingo (14 січня 2000). Engineering the Provitamin A (β-Carotene) Biosynthetic Pathway into (Carotenoid-Free) Rice Endosperm. Science (англ.) 287 (5451). с. 303–305. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.287.5451.303. Процитовано 2 листопада 2022. 
10. Koller, B H; Smithies, O (1992-04). Altering Genes in Animals by Gene Targeting. Annual Review of Immunology (англ.) 10 (1). с. 705–730. ISSN 0732-0582. doi:10.1146/annurev.iy.10.040192.003421. Процитовано 2 листопада 2022. 
11. Alberts, Bruce; Wilson, John; Hunt, Tim (2008). Molecular biology of the cell (вид. 5th ed). New York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4105-5. OCLC 82473851. 
12. Foreign Press Centers. United States Department of State (амер.). Процитовано 2 листопада 2022. 
13. Insulin aspart. Wikipedia (англ.). 24 жовтня 2022. Процитовано 2 листопада 2022. 
14. Von Fange, Tim; McDiarmid, Todd; Mackler, Leslie; Zolotor, Adam (2008-09). Clinical inquiries: can recombinant growth hormone effectively treat idiopathic short stature?. The Journal of Family Practice 57 (9). с. 611–612. ISSN 1533-7294. PMID 18786336. Процитовано 2 листопада 2022. 
15. Fernandez, Marifel Mitzi F.; Hosey, Robert G. (2009-01). Performance-enhancing drugs snare nonathletes, too. The Journal of Family Practice 58 (1). с. 16–23. ISSN 1533-7294. PMID 19141266. Процитовано 2 листопада 2022. 
16. Manco-Johnson, Marilyn J. (1 січня 2010). Advances in the Care and Treatment of Children with Hemophilia. Advances in Pediatrics (English) 57 (1). с. 287–294. ISSN 0065-3101. PMID 21056743. doi:10.1016/j.yapd.2010.08.007. Процитовано 2 листопада 2022. 
17. Foreign group roots for 'golden rice' in India. Deccan Herald (англ.). 18 березня 2015. Процитовано 2 листопада 2022. 
18. Funke, Todd; Han, Huijong; Healy-Fried, Martha L.; Fischer, Markus; Schönbrunn, Ernst (29 серпня 2006). Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences (англ.) 103 (35). с. 13010–13015. ISSN 0027-8424. PMC PMC1559744. PMID 16916934. doi:10.1073/pnas.0603638103. Процитовано 2 листопада 2022. 
19. Mendelsohn, Mike; Kough, J.; Vaituzis, Zigfridais; Matthews, K. (2003). Are Bt crops safe?. undefined (англ.). Процитовано 2 листопада 2022.